Jan urodził się w 1580 r. we Włodzimierzu Wołyńskim. Pochodził z rodziny mieszczańskiej. Wysłany do Wilna, aby przysposobił się do zawodu kupieckiego, zetknął się tam ze sprawą unii. W 1604 r. przyjął habit bazyliański oraz imię Jozafat. W pięć lat później po studiach teologicznych został kapłanem.
W wieku 38 lat został arcybiskupem unickim w Połocku, gdzie podjął pracę bardziej misjonarza niż pasterza. Będąc biskupem nadal prowadził życie skromne i surowe. Swoje jednoizbowe mieszkanie dzielił z bezdomnym. Jego działalność budziła niezadowolenie przeciwników unii z Kościołem Rzymskim. Po powrocie z sejmu w Warszawie (1621) doszło nawet do zamieszek i tumultów prawosławnej ludności. Kiedy wyszedł do tłumu demonstrującego przed jego mieszkaniem w Witebsku 12 listopada 1623 r., został napadnięty i zabity. Sponiewierane ciało Świętego utopiono w Dźwinie.
Arcybiskup Jozafat został beatyfikowany w 1643 r., kanonizowany w 1867 r. Jest patronem diecezji siedleckiej, drohiczyńskiej, zakonu bazylianów, Rusi, Litwy, Wilna. Jego relikwie odbyły tułaczą i długą drogę. W związku z rozszerzającym się wpływem prawosławia na terenach wschodnich Królestwa Polskiego były one składane w miastach Białorusi, na Litwie, w Polsce. W 1667 r. powróciły do Połocka. W 1706 r. z obawy przed profanacją umieszczono je w kaplicy zamku Radziwiłłów w Białej Podlaskiej. Po kanonizacji Świętego carat zażądał, aby je ukryto w podziemiu kościoła bazylianów. W 1916 r. przewieziono je do kościoła bazylianów św. Barbary w Wiedniu. Od 1949 r. spoczywają w bazylice św. Piotra na Watykanie.

W ikonografii św. Jozafat Kuncewicz przedstawiany jest w stroju biskupim rytu wschodniego. Jego atrybutem jest topór.